人体真菌组与疾病

[摘要]  真菌组在人体微生物组中所占比例不到1%，但真菌群落在人体健康与疾病状态中扮演着关键角色。近年来随着高通量测序技术的广泛应用，人体不同部位如口腔、肺部、消化道、阴道以及皮肤真菌组的结构和组成被解析，其在人体健康和疾病中的重要地位也被挖掘。同时，人体真菌组对细菌组的组成也有影响，是维持微生物组结构和代谢功能稳定的关键物种；真菌组对宿主的免疫应答作用也对某些疾病的发生发展有显著影响。本文综述了人体不同部位健康与疾病状态下真菌组组成情况以及真菌组与细菌组、宿主免疫的相互作用。
[关键词]  真菌组；疾病；细菌组；相互作用；宿主免疫反应
   
   人体携带了数十亿的微生物，这些与人类共存但在特定条件下可以导致各种疾病的微生物（包括细菌、真菌、古细菌和病毒等）遗传信息的总和叫做人体微生物组，它们在揭示人体健康疾病状态方面有重要意义[1]。自2007年NIH开展人类微生物组计划（human microbiomeproject，HMP）以来，已经有了许多对人体细菌组学领域的研究，但对真菌组学的研究相对较少。真菌组在人体微生物组中所占比例很少，不到1%[2-3]，这是研究过程中的主要障碍，除此之外，真菌种属鉴定分子分类工具的缺乏、基因数据库不完善以及大部分真菌尚不能培养也使人体真菌组学的研究发展面临巨大挑战。但真菌组在人体健康与疾病状态中扮演着关键角色，在维持微生物群落的结构和代谢功能中有不可取代的地位，其通过与细菌组相互作用、参与宿主的免疫应答反应，从而调控炎症反应的程度[4]，影响人体健康疾病状态。尤其对于一些免疫缺陷综合征、器官移植和癌症化疗的患者，由于免疫系统受到抑制更易遭受真菌感染，感染死亡率高达35%~45%[5]。近年来随着高通量测序技术的广泛应用，人体不同部位如口腔、肺部、消化道、阴道以及皮肤真菌组的结构和组成被解析，其在人体健康和疾病中的重要地位也被挖掘。同时，人体真菌组对细菌组的组成也有影响，是维持微生物组结构和代谢功能稳定的关键物种；真菌组对宿主的免疫应答作用也对某些疾病的发生发展有显著影响。本文综述了人体不同部位健康与疾病状态下真菌组组成情况以及真菌组与细菌组、宿主免疫的相互作用。
1  口腔真菌组
    口腔是微生物群落在人体寄居的重要窗口之一，由于其解剖位置的特殊性，口腔微生物对口腔以及全身健康状态的维持都有至关重要的作用。口腔中约有700多种细菌，口腔常见疾病如龋病、牙龈炎、牙周炎等都与细菌组之间有密切联系。相比于细菌组，口腔真菌组与口腔健康和疾病之间的关系探讨较少。研究[6-7]表明，口腔真菌组大约超过50%都属于子囊菌门，其次是担子菌门、结合菌门、壶菌门、球囊菌门等。口腔具有多个微生态环境完全不同的生态位点，研究所取样本的位点不同以及对真菌组测序的序列不同，往往会检测到不同的真菌属。Ghannoum等[6]对20例健康人群口腔含漱液中的真菌组进行ITS区域测序，首次报道了健康人群口腔中真菌组的多样性构成情况，并对健康人群核心口腔真菌组（检出率大于20%）进行了定义。他们共检测出了可培养的真菌属74个、不可培养真菌属11个，其中念珠菌属检出率最高，其次是枝孢属、短梗霉属、酵母属、曲霉属、镰刀菌属、隐球菌属。随后，Dupuy等[7]对健康人群的唾液样本进行真菌ITS1区域测序发现，唾液样本中除了上述研究检出的真菌属，还有一种皮肤的常驻真菌属马拉色菌的检出率也很高（13%~96%）。该研究首次在口腔中检测出了马拉色菌属，重新定义了健康人群核心口腔真菌组。最近，本课题组对18名健康人群唾液样本真菌组ITS2区域进行Illumina MiSeq测序，共检测出280个真菌属，其中念珠菌属、酵母属、子囊菌门未鉴定属、酵母目未鉴定属、被孢菌属、毛孢子菌属、青霉属、木霉属这8个真菌属的丰度都在1%以上，同时也检测到马拉色菌属的存在。随着真菌组测序技术的进步和分子分类工具的完善，将有更多以前未被鉴别定义的口腔真菌种属为大家所了解，为更好地解释口腔真菌组与人体健康疾病的关系打好基础。
    口腔微生物群落稳定状态的维持有助于口腔健康，口腔微生物组菌群的失调与炎症性疾病的发生有关，其中真菌群落的失调对宿主免疫也有不利作用，不同疾病状态下口腔真菌组的结构组成也会发生变化。口腔念珠菌病患者与健康人群相比，真菌组在属的水平上都以念珠菌属为主，但在种的水平上存在差异，口腔念珠菌病患者非白色念珠菌如都柏林念珠菌明显高于健康人群，提示非白念珠菌与口腔念珠菌病的发生也有一定的关联性[8]。本课题组对扁平苔藓患者唾液样本研究发现，念珠菌属和曲霉菌属的丰度和检出率都显著升高。Persoon等[9]在根尖周炎患牙根尖组织中检测发现念珠菌属和马拉色菌属检测率较高。当机体免疫功能缺陷或受到抑制时，口腔环境更易发生真菌菌群失调。人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染和糖尿病患者口腔中念珠菌属多处于过度生长的状态，常伴发口腔念珠菌病。Mukherjee等[10]研究发现，HIV感染人群含漱液样本中细菌组构成无明显改变，但真菌组构成却并不相同：念珠菌属、附球菌属、链格孢属在HIV感染患者中检出率较高（大于20%），而健康人检出率最高的依次是念珠菌属、毕赤酵母属、镰刀菌属。目前关于不同疾病状态下口腔真菌组失调的研究多局限于不同真菌属之间丰度与检出率的变化，缺乏对其发生机制的探讨，主要原因在于大部分真菌属难以用培养分离的方式对其进行验证。
    口腔环境中微生物群落的稳定主要通过菌群之间的相互作用来维持。真菌组与细菌组之间主要通过物理性黏附、共聚和群体感应以及真菌与细菌的代谢产物等3个途径来实现相互协同共生或者相互拮抗，调节菌群之间的平衡，维持机体的健康状态。口腔中多种微生物可形成互养集团共生，比如念珠菌属、普雷沃菌、瘤胃球菌和甲烷短杆菌之间具有协同作用。念珠菌属可代谢复杂的碳水化合物，而普雷沃菌和瘤胃球菌可发酵念珠菌产生的单糖，甲烷短杆菌能使用这些细菌发酵的产物从而产生甲烷和二氧化碳[3]。戈登链球菌产生的葡萄糖基转移酶对白色念珠菌也有协同作用，促进生物膜的形成[11]。牙齿硬组织的体外研究[12]发现，白色念珠菌与金黄色葡萄球菌之间存在协同作用，念珠菌属与细菌发生共聚黏附后形成“玉米棒子”样的结构，充当“连接桥”的作用，可以减弱唾液对细菌的冲刷作用。此外，金黄色葡萄球菌黏附在白色念珠菌上时使其对抗菌药物的易感性下降[13]，更容易产生耐药。口腔真菌组与细菌组之间还存在拮抗作用。Mukherjee等[10]研究发现，HIV患者口腔中毕赤酵母属与念珠菌属存在负相关关系，毕赤酵母属可以抑制念珠菌属菌丝的形成。Hogan等[14]研究发现，铜绿假单胞菌生长密度过大时会产生一种信号分子，使白色念珠菌从菌丝态转变为酵母态，导致假铜绿单胞菌不能黏附在其菌丝上，同时也降低了白色念珠菌的毒力。念珠菌属和链球菌属之间也有类似相互作用，变异链球菌产生的感受态刺激因子在早期可以抑制白色念珠菌从酵母态转变为菌丝态，从而影响白色念珠菌的毒力[15]。但白色念珠菌可以利用变异链球菌产生的乳酸盐作为维持其生长的碳源，因此白色念珠菌与变异链球菌二者之间的关系还有待商榷。
2  肺部真菌组
    人体呼吸系统暴露在一个大约每立方空气中就有5万个真菌孢子的环境之中，对于一些长期抗菌治疗或者免疫功能受到抑制的患者，真菌在肺部的定植常作为引起全身性真菌感染的首要窗口。在过去很长一段时期研究者认为肺部在健康状态下处于无菌的状态，只有疾病发生时微生物才会在肺部定植。分子分类鉴别比对基因库的缺乏和取材过程中容易受到口腔和上呼吸道菌群的污染等原因也阻碍了肺部真菌组研究的发展[16]。但最新研究表明健康人群肺部并不是无菌的，大部分定植在肺部的真菌多是通过呼吸作用从外界环境中吸入或者口腔中的真菌迁移而来，所以真菌组在个体间差异较大但丰度较低，菌群极不稳定。Tipton等[17]研究认为，人体健康状态下肺部与外界环境之中存在的真菌属具有较高的相似性，最常见的真菌属是小戴卫霉菌属、枝孢属、散囊菌属、青霉菌属和曲霉属等。但当肺的生理状态改变时（如疾病状态下），真菌组多样性下降，群落构成稳定性变高。例如大部分囊性纤维化患者的肺部真菌组以念珠菌属、曲霉菌属、马拉色菌属为主，且随着疾病程度的加重，真菌组多样性减小[18]。肺移植患者的肺部真菌组成与健康人群相比，多样性也呈下降趋势，但某些真菌如念珠菌属丰度却是增加的[19]。根据肺部生理状态改变伴随真菌组稳定性变化这一规律，在临床工作中用高通量测序的方法检测肺部真菌组多样性的变化，可以用来评估患者肺部功能的变化以便于指导临床治疗。
3  消化道真菌组
    人体消化道真菌组约占整个微生物组的0.1%[3]，主要伴随食物进入消化道，在黏膜上定植成为常驻菌群或者随粪便排泄出去，大部分属于子囊菌门、担子菌门和接合菌门[20-25]。不同的饮食摄入类型可对消化道的真菌组多样性产生影响。高蛋白饮食人群青霉菌属的丰度明显增加，而以植物性饮食为主的人群则以念珠菌属的丰度相对较高[25]。由于消化道涉及多个不同微环境的部位，所以机体在健康状态下不同部位之间真菌组差异较大。胃液样本中可以检测到念珠菌属和单胞瓶霉属，因为其具有耐受低pH值的环境的特性[20]。小肠黏膜由于样本取材比较困难，该部位真菌组的多样性研究较少。Ott等[21]用活检取材的方法，发现在人体结肠黏膜中检出率最高的依次是座囊霉属、溶磷白地霉和黑粉菌属。Hamad等[22]从健康人群的粪便样本中发现了27种真菌，其中溶磷白地霉检出率最高。Hoffmann等[23]从健康人群的粪便中检测出了66个真菌属、184个真菌种，其中酵母属检出率最高，其次是念珠菌属和枝孢菌属。Mar Rodríguez等[24]从健康人群的粪便中检测出了75个真菌属，检出率最高的依次是毛霉属、念珠菌属、青霉菌属和酵母属、曲霉菌属。以上研究可以发现肠道真菌组的多样性和高度变化，由于大部分研究取样均为粪便标本，该样本包括了许多一过性的真菌种属，因此用粪便样本来分析真菌组多样性并不能完全代表消化道实际的真菌组构成情况。目前对人体健康状态下消化道真菌组的多样性尚未有共识，但肠道黏膜取材的样本检测出来的真菌组稳定性相比于粪便标本更高一些[26]。
    消化道真菌群的多样性和稳定性的改变与机体健康疾病状态密切相关，比如一些炎性肠病患者如克罗恩病和溃疡性结肠炎，与健康人群相比，肠道中担子菌门/子囊菌门的比例增加，酿酒酵母菌的比例降低，白色念珠菌的比例增加[27]。肥胖人群的肠道真菌组与健康人群相比在科的水平上真菌组多样性明显下降，其中毛霉菌属是健康人群中的优势菌而在肥胖人群中检出率很低，提示该真菌属可能与体重的减轻相关[26]。
    真菌组在肠道的定植也受到细菌组的调控。在炎性肠病中，大肠埃希菌、黏质沙雷菌和热带念珠菌三者之间有协同作用[27]，三者在肠道局部形成一层菌膜，介导炎症的发生。热带念珠菌的菌丝可以破坏肠黏膜组织，激发免疫应答，黏质沙雷菌能在大肠埃希菌和真菌之间形成交联桥，大肠埃希菌和黏质雷氏菌的脂多糖又可以促进菌膜的成熟，因此这层生物膜使微生物可以抵抗免疫细胞的攻击，体外研究也证实了这一点，发现三者形成的生物膜均显著大于单物种和双物种生物膜。肠道真菌组与细菌组之间也存在竞争拮抗作用。小鼠实验发现短期抗生素的使用使肠道细菌组多样性下降而念珠菌属的丰度增加[28]。白色念珠菌在小鼠肠道定植后肠道细菌拟杆菌门和互养菌门的比例下降而厚壁菌门没有明显的变化，但白色念珠菌引起肠道细菌组的变化是否是一过性的变化以及如何作用于宿主还有待进一步研究[29]。
4  阴道真菌组
    阴道是一个真菌群落比较丰富的环境，其中超过50%的真菌组属于子囊菌门，主要是酵母目，最常见的是念珠菌属，其次是枝孢属、散囊菌属、链格孢属和红酵母属，还有一部分属于未鉴别的真菌属[30-32]。真菌在阴道的定植生长受到机体免疫防御系统和其他微生物种类的共同影响。阴道真菌组多样性的变化与妊娠、抗生素的使用、HIV感染、糖尿病、复发性外阴阴道念珠菌病的发生均有一定的关联性[33-34]。妊娠期间阴道黏膜上皮由于雌激素水平和糖原生成增高，念珠菌属可达到总菌群的40%，临床研究的证据表明母亲阴道念珠菌比例的增加可能与早产儿的发生有一定的联系，但具体机制还未得到证实[35]。乳酸杆菌在健康人群的阴道中是优势菌，其产生一些乳酸有利于阴道维持一个酸性环境，从而抑制真菌的生长，还可以和念珠菌属竞争与黏膜上皮细胞结合位点[35]，从而减少念珠菌在阴道的定植，维持微生物群落的稳定。抗生素的使用使乳酸杆菌的数量下降而念珠菌属得以大量生长，更容易患阴道念珠菌病。
5  皮肤真菌组
    相比于人体其他部位，皮肤具有温度较低、较干燥，含有大量脂质和蛋白（如角蛋白）的特性，为一些亲脂性的真菌属如马拉色菌属提供了丰富的营养物质[36-37]，有利于这些菌在皮肤的定植，成为优势菌属。Findley等[36]对健康人不同皮肤部位进行测序，明确了皮肤上正常真菌组的多样性，为研究真菌性皮肤病打下了基础。该研究发现不同的皮肤部位真菌群落构成不同，头部和躯干上马拉色菌属是主要的优势菌，其中头皮、前额多为球形马拉色菌，后背多为限制性马拉色菌。手部真菌含量较少，与之相反的是足部真菌多样性较高（40~80个真菌属），除了马拉色菌属还检测到红酵母属、德巴利酵母属、隐球菌属和念珠菌属等真菌属，但随时间的推移真菌群落的稳定性下降，其原因可能与足部频繁地与外界环境接触有关。马拉色菌属是皮肤上的常驻菌，与角质形成细胞、免疫细胞的相互作用使得这种共生关系转化为致病关系，转变为致病状态的机制尚不清楚，可能与其产生或者分泌刺激性脂肪酸导致皮肤过度增殖和产生鳞屑有关[38]。头皮的脂溢性皮炎也称为头皮屑，主要就是由限制性马拉色菌和球形马拉色菌引起。当皮肤的完整性受到破坏时，比如糖尿病患者足部形成溃疡后，致病性真菌在创口表面定植的速度较快，往往加重病情。大约80%的患者足部可检测到真菌，包括子囊菌门和担子菌门里的17种真菌种（检出率均大于1%），其中腊叶芽枝霉和白色念珠菌的检出率较高，推测其有助于慢性感染的加重[39]。皮肤上的真菌和细菌也存在一些相互作用，比如在足部，放线菌门和子囊菌门、担子菌门在丰度上呈负相关关系，具体机制还不是很清楚[37]。
6  真菌感染与宿主抗真菌免疫反应
    机体免疫力下降或者免疫功能受到抑制时，口腔、肺部、消化道、阴道和皮肤等部位更容易发生真菌菌群的失调和真菌感染。当念珠菌属、马拉色菌属、曲霉属等真菌感染时，体内的上皮细胞和固有免疫细胞如吞噬细胞和树突状细胞通过不同的受体分子来识别和处理真菌的表面抗原成分，通过不同途径共同作用抵抗真菌的感染。其中树突状细胞相关性C型植物血凝素-1（C-type lectin domain family 7 member A，Dectin-1）在固有免疫细胞吞噬和杀灭真菌中具有重要作用[40]，可以特异性地识别念珠菌属、曲霉等真菌细胞壁的β-1,3-葡聚糖，介导细胞因子的产生从而影响T细胞的分化，实现宿主抗真菌免疫反应的作用。动物研究发现，该受体分子具有抗全身性念珠菌病感染作用，并且在很多部位如口腔黏膜[41]、肺部[42]、皮肤[43]等都具有调控作用。真菌感染时，上皮遭到破坏，大量的中性粒细胞和单核细胞浸润，产生炎性细胞因子并募集更多的固有免疫细胞和适应性免疫细胞，后者主要是辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17），共同参与抗真菌免疫反应。浸润的中性粒细胞还可以通过释放大量的活性氧来直接杀灭真菌。受感染的上皮细胞可以产生抗菌肽来影响真菌在宿主表面的存活。另外研究[44]发现，Th17免疫细胞的缺陷与口腔中念珠菌属的过度生长有紧密的联系，提示Th17细胞在抗真菌免疫中有重要作用。3型固有淋巴细胞（innate lym-phoid cell 3，ILC3）也可直接与真菌作用或者通过其他免疫细胞产生的白细胞介素（interleukin，IL）2和17来发挥抗真菌作用。
    综上，本文探讨了近年来人体不同腔道黏膜表面在健康和不同疾病状态下真菌组的构成和多样性的改变、真菌组与细菌组通过相互作用维持或改变微生物群落的稳定、宿主抗真菌免疫反应的主要途径等方面的研究进展，为进一步明确真菌组与人体疾病的关系提供了方向。随着高通量测序技术的快速进展，人们对人体各部位真菌群落的组成和多样性研究均取得了一定的进展，但是对真菌组的功能组学及其在人类健康和疾病中的具体作用机制还知之甚少，这是今后的研究中值得探讨的部分。

注射用伏立康唑，本品是一种广谱的三唑类抗真菌药，其适应症如下：
治疗侵袭性曲霉病。治疗对氟康唑耐药的念珠菌引起的严重侵袭性感染（包括克柔念珠菌）。治疗由足放线病菌属和镰刀菌属引起的严重感染。本品应主要用于治疗免疫缺陷患者中进行性的、可能威胁生命的感染。
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