高效液相色谱法测定人血浆中伏立康唑的含量

作者
李敏1a，2 ，陈超阳1a，许俊羽1a，马凌悦1a，康子胜1b，李欣然1a，2 ，赵侠1a，周颖1a，崔一民1a

( 1. 北京大学 第一医院，a. 药剂科; b. 临床药 理研究所，北京 100034; 2. 北京大学 药学院 药事管理与临床药学系，北京 100191)

来源
中国临床药理学杂志 第34卷 第3期2018年2月( 总第 257 期)316-318

摘要
目的 建立高效液相色谱法测定人血浆中伏立康唑浓度的方法学。

方法 色谱柱: ZOＲBAX Eclipse Plus C18，柱温: 40 ℃，流速: 1 mL·min－1，流动相: 甲醇 － 水 = 55∶ 45，检测波长: 254 nm，内标: 对氯苯乙酰胺。考察该方法的专属性、标准曲线与定量下限、精密度与回收率、稳定性。

结果 血浆中内源性杂质对样品测定无干扰，血浆中伏立康唑在 0. 1 ～ 10. 0 μg·mL－1内线性良好( r = 0. 999 2) ，最低检测浓度为 0. 1 μg·mL －1。血浆中伏立康唑日内、日间ＲSD 均 ＜ 10% ，提取回收率为 89% ～ 92% 。

结论 本方法简便、灵敏、准确、高效，适用于人体内伏立康唑的浓度监测。

关键词
伏立康唑; 代谢物; 高效液相色谱法; 血浆

中图分类号
Ｒ978. 1

文献标志码
A

文章编号
1001 － 6821( 2018) 03 － 0316 － 03

ＤＯＩ
10. 13699 /j. cnki. 1001 － 6821. 2018. 03. 038

伏立康唑( VＲC) 是第 1 个临床有效的第Ⅱ代三唑类广谱抗真菌药，对曲霉菌、假丝酵母菌、新型隐球菌和一些不常见的霉菌均有效［1］，尤其对侵袭性曲霉菌浸润干扰疗效很好。伏立康唑可以口服或静脉注射，在口服后 2 h 可迅速吸收，生物利用度超过 90% 。成人体内伏立康唑的消除呈非线性药代动力学，儿童体内消除呈线性，需要高剂量才能达到成人的血药浓度［2］。伏立康唑主要经肝细胞色素P450( CYP450) 酶系代谢，很大程度受到 CYP2C19 基因型的影响［3］。CYP2C19 具有基因多态性，且在种族间有显著差异。因此，建议进行伏立康唑的临床治疗药物监测，以便及时调整给药方案，实现个体化用药。本文建立一种简便、灵敏、准确、高效的 HPLC 方法，用于人血浆中伏立康唑的浓度测定，实现伏立康唑的治疗药物监测。

材料与方法     
1 药品与仪器
伏立康唑，纯度: 100% ，批号: 100862 － 201402;氟康唑，纯度: 100% ，批号: 100314 － 201204; 对氯苯乙酰胺，纯度: 100% ，批号: 100850 － 201102，均购自中国食品药品检定研究院。空白健康人血浆样本，北京大学第一医院血库提供。

1100 高效液相色谱系统，美国 Agilent 公司产品;Micro17 台式离心机，美国 Thermo 公司产品。



2 色谱条件
色谱柱: ZOＲBAX Eclipse Plus C18 柱( 4. 6 mm ×250 mm，5 μm) ，流动相: 甲醇 － 水( 55 ∶ 45) ，柱温:40 ℃，流速: 1 mL·min－1，检测波长: 254 nm，进样量:20 μL，内标: 5 μg·mL－1对氯苯乙酰胺。



3 溶液的配制
伏立康唑标准品用甲醇配制成相当于1 mg·mL－1伏立康唑储备液，置于 4 ℃保存。临用时，用甲醇稀释成相应的浓度。对氯苯乙酰胺( 内标) 用甲醇配置成相当于 20 μg·mL－1储备液，临用时稀释至 5 μg·mL－1。




4 样品处理方法
取血浆标本 200 μL，加入内标对氯苯乙酰胺工作液 20 μL 和伏立康唑标准液 20 μL 于 1. 5 mL 离心管中，震荡混匀。加入甲醇 600 μL 沉淀蛋白，震荡混匀1 min，以 1. 2 × 104r·min－1离心 10 min，吸取上清液20 μL，进样分析。



5 方法学考察
专属性 取空白血浆，加入对照品( 伏立康唑、氟康唑和内标对氯苯乙酰胺) 配制的血浆样品，按“样品处理方法”操作并进样测定。

标准曲线与定量下限 取空白血浆 200 μL，加不同量的标准品，使其质量浓度分别为 0. 1，0. 5，1. 0，2. 5，7. 5，10. 0 μg·mL－1。按“样品处理方法”操作，记录样品和内标峰面积，以伏立康唑/对氯苯乙酰胺峰面积比( y) 对伏立康唑浓度( x) 进行线性回归。以S /N≥10，同时满足准确度和精密度要求的标准血浆样品最低浓度为定量下限。

精密度与回收率 配制 0. 3，2. 5，9. 0 μg·mL－1的低、中、高质量浓度的标准品血浆样品，按“样品处理方法”操作，每种浓度平行测定 5 份样本，计算日内和日间的 ＲSD。另取甲醇 200 μL 作基质分别配制0. 3，2. 5，9. 0 μg·mL－1的低、中、高质量浓度的样品，每种浓度平行测定 5 份样本，计算回收率。

稳定性 配制 0. 3，2. 5，9. 0 μg·mL－1的低、中、高质量浓度的血浆样品，室温放置 24 h、冻融 3 次、－ 20 ℃放置 30 d 后，按“样品处理方法”操作，考察其稳定性。

结 果     
1 方法学评价
专属性 伏立康唑和内标对氯苯乙酰胺的保留时间分别约为 12. 6 和 7. 0 min，血浆样品内源性杂质及氟康唑不干扰伏立康唑的测定。色谱图见图 1。


标准曲线与定量下限 伏立康唑在 0. 1 ～ 10. 0μg· mL－1内，线 性 关 系 良 好。标准回归方程为y = 1. 93x + 2. 40 × 10 － 3 ( r = 0. 999 2) ，定量下限为 0. 1μg·mL－1。

精密度与回收率 提取回收率为样品结果与基质样品结果比值，日内，日间 ＲSD 和回收率，见表 1。


稳定性 血浆样品经室温放置，反复冻融和长期低温保存均稳定，ＲSD 均＜ 15% 。

2 方法学验证
用本研究建立的方法为 4 例患者进行血药浓度监测，其中 T 细胞母细胞白血病 3 例，急性单核细胞性白血病1例; 男女比例为 1 ∶ 1; 平均年龄为( 37. 25 ± 6. 50) 岁。测得最大血药浓度达 5. 51μg·mL－1，最小为 0. 5 μg·mL－1; 其中在治疗窗内 3例，占 75. 00% ; 高于治疗窗 1 例，占 25. 00% 。

   讨 论   
目前，关于伏立康唑的有效治疗浓度范围还未有统一 标 准，国外推荐的谷浓度一般为 1. 0 ～ 5. 5μg·mL－1［4］。测定血浆中伏立康唑的方法主要有HPLC 紫外检测法、HPLC 荧光检测法、HPLC－MS法、GC－MS 法［5］和免疫分析测定法［6］等，但国内尚无文献报道。其中，荧光检测法在进行定量分析中，需要排除一些干扰，如背景荧光等。液质法样品处理步骤复杂、仪器昂贵、成本较高，在临床均难推广。
本文优化了液相色谱条件，流动相为甲醇－水( 55∶ 45) 。该流动相不含缓冲盐溶液，分析过程中柱压低、分析时间短、分析效率高，有效延长色谱柱寿命，保护色谱系统。同时，伏立康唑和内标的峰形均很好，保留时间分别为 12. 6 和 7. 0 min。有文献通过固相萃取来处理样品，这种方法需要较多不同的溶剂，同时操作复杂，步骤繁琐。本文血浆处理方法采用 3∶ 1 甲醇直接沉淀法，该方法沉淀充分，提取回收率较高，成本较低且简单易行，省去固相萃取、液液萃取等复杂操作。内标选用考虑氟康唑，在确定的色谱条件下，氟康唑的保留时间与伏立康唑相差较大，且峰形偏小。最后选用对氯苯乙酰胺作为内标物质，对氯苯乙酰胺在选定的色谱条件下性质稳定，峰形良好，与伏立康唑能完全分离，保留时间合适且无内源性杂质的干扰。方法学验证结果显示，提取回收率 ＞85% 。在0. 1～ 10. 0 μg·mL －1内，在相应的生物样品中标准曲线的r ＞ 0. 99，质控样本及稳定性试验符合要求。此方法完全可以满足开展伏立康唑治疗药物监测工作的需求。