HPLC含量分析方法开发—专属性

“要努力，但是不要急。繁花锦簇，硕果累累都需要过程 。”学习是一个持续不断的过程，需要我们一直坚持。
阅读提示：本文仅供闲来讨论，不作实战指导；阅读思路以围绕目标进行小范围思维的就事论事，不作发散性思考（很多问题发散后有一万种可能）。
背景介绍
当采用色谱分析进行方法建立时，专属性是必然需要考虑的问题之一，相关的指导原则明确要求提供专属性图谱，并对成分进行标注。在有关物质方法开发时，毫无疑问，所有的杂质均需要进行相互有效分离；尽管有时无法达到基线分离，但至少达到分离度1.0~1.2，或者设置峰谷比的限制，以满足定量检测要求。而以各种主客观理由陈述杂质无法分离，采用两个杂质（无法分离，重合为一个色谱峰）合并计算的方式，已有被CDE发补案例。因此，对于专属性，色谱分离是无法回避的要求。
但主成分含量检测呢？是否必须要求主成分与杂质谱中罗列的所有杂质进行完全分离？那若是固体制剂溶出度的方法也采用HPLC-UV的方法，是否也要考虑主成分与所有杂质的分离？那建立的方法对于溶出曲线的检测可能是个灾难！
相信很多人在含量方法建立时有过这种专属性的纠结，最终不管是否坚持了完成主成分与杂质分离的方式，心中也是有些忐忑；尤其对于项目经验不多，接受CDE审评次数尚少的研发人员而言：完成分离吧，可能牺牲方法的便捷性，不管那些杂质吧，担心专属性被质疑。
那到底如何看待这个问题，本文抛砖引玉，供大家讨论。

02案例分享

案例1：
某3类化药项目，无参考标准，存在15个杂质，在“废了”九牛二虎之力之后，有关物质检查采用60min梯度方法完成专属性开发（图1）：主峰前后各有一个紧邻的分离的不是异常彻底的杂质峰（限度为均不得过0.15%，其他最大单杂不得过0.10%）。


图1  案例1有关物质专属性效果图

在此不推测有牛人能做出分离达十万八千里的方法，仅以当前分离状态讨论含量方法的开发，即假设当前已是分离到极限的状态了。

包括但不限于有以下几种可能的观点：

‍A：如果杂质A和B任何一个为实际能检出的杂质，直接采用有关物质的分析方法进行含量检测，杂质A和B与主峰的分离必须考虑，缺点就是含量检测时间较长；如果均为未检出，可以考虑重新开发运行时间较短（比如等度洗脱）的含量检测方法，专属性仅考察样品中实际检出的杂质。
B：不论杂质A和B是否实际检出，均要考虑其与主峰的专属性问题，也就是只能采用有关物质的方法进行含量检测，因为等度洗脱或其他方法无法完成杂质A、B与主峰的有效分离。
C：不论杂质A和B是否实际检出，均无需考虑。通过降低样品浓度，或者选择其他波长等手段，达到最大杂质也无法检出的效果，以排除其他色谱峰对主峰的干扰。即使高浓度或特定波长定位时发现杂质与主峰完全重合，也无需担心其对含量检测的干扰。如此一来，可能建立一个等度洗脱5~10min的方法即可完成含量检测，岂不快哉！
当然，如果杂质很大，灵敏度很高，上述方式无法规避其干扰（相信按当前杂质控制水平，大多情况下均能实现有效规避），还是要完成分离，但这也仅限于实际能检出的杂质，对于推测的无检出的理论杂质无需多虑。

案例2：
某4类化药项目，有药典（ChP，EP，USP）参考标准，存在15个杂质，药典收载有关物质检查采用60min梯度方法（图2）：主峰前后各有一个紧邻的分离的不是异常彻底的杂质峰（限度为均不得过0.15%，其他最大单杂不得过0.10%）。

含量采用有关物质色谱条件（即60min梯度）及样品浓度，按外标法进行检测。




图2  案例2有关物质专属性效果图

通过方法确认，能够完美重现药典方法。
问题：如果觉的含量采用60min方法检测稍显耗时（当然，有人觉的60min无所谓则不在此讨论范围），在案例1中C观点规避干扰的方法可以实现的情况下，你敢不敢抛弃药典收载的方法，换成一个5~10min的方法？

个人赞成上述案例1中的C观点，对于案例2中的问题：干！
惶论如下：
03专属性定义及要求

干也不能莽干，肯定得考虑一下是否有那么一点理由支持这么干。俗话说，民不与官斗，先看一下官方要求：

1、中国药典《9101 分析方法验证指导原则》
定义：专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能正确测定出被测物的能力。

要求：鉴别反应、杂质检査和含量测定方法，均应考察其专属性。

在杂质对照品可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加人杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质或辅料的试样比较测定结果。

在杂质或降解产物不能获得的情况下，可将含有杂质或降解产物的试样进行测定，与另一个经验证的方法或药典方法比较结果。也可强制破坏，以研究可能的降解产物和降解途径对含量测定的影响。含量测定方法应比对两种方法的结果。

如方法专属性不强，应采用一种或多种不同原理的方法予以补充。

2、日本药典
相关描述与中国药典基本一致。
3、美国药典
相关描述与中国药典基本一致。
4、ICH Q2(R1)
相关描述与中国药典基本一致。

但对于中国药典中“如方法专属性不强，应采用一种或多种不同原理的方法予以补充。”（USP中有类似描述），ICH Q2(R1)文中给出了更有指导性的一段文字。

不失真义上原文：In cases where a non-specific assay is used, other supporting analytical procedures should be used to demonstrate overall specificity. For example, where a titration is adopted to assay the drug substance for release, the combination of the assay and a suitable test for impurities can be used.
抛砖引玉一陋译：如果采用了一个非专属的含量检测方法，应采用其他可以支持整体质量控制具有专属性的方法进行补充。比如，采用了容量法进行含量检测用于原料药放行，在质量标准中应同时制订含量检测与杂质检测（杂质检测方法应具专属性）。

04抽丝

从上述官文中可以得出以下几点结论：1、 含量检测也是必须要考虑专属性问题的。
2、 质量控制中允许存在非专属性，或者专属性不怎么好的含量检测方法，典型如容量法。
3、 单一的非专属性含量检测用于放行是不能接受的，需辅以杂质检测。

05剥茧

官方指导原则中“如方法专属性不强，应采用一种或多种不同原理的方法予以补充。”到底为何意？该如何理解，进而如何操作？
目前仅ICH Q2(R1)举出一例：容量法测含量，辅以杂质检测。
试问现在有几个质量标准里没有杂质检测这一项？甚至HPLC，GC，MS全上！

那么对于现阶段大多数原料药的生产水平及杂质质控限度，在开发HPLC方法检测含量时，不管杂质峰还是主峰全干成一个峰进行检测，有何不可？
何况那些总杂限度为0.5%、1.0%甚至更低的原料药！

更何况那些总杂实际检出水平在0.1%左右的原料药？
药典其实允许含量检测方法的不专属，毕竟如果含量检测方法专属性那么强，那不就是杂质检测方法了吗？不是不行，就是有点劳民伤财。
06结语

还记得分析方法验证指导原则的开头一句是什么吗？分析方法验证的目的是证明建立的方法适合于相应检测要求，英文是“for its intended purpose”。

那么开发每一个方法的目的是什么呢？这决定了我们的开发策略！
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