sop操作高效液相色谱法标准操作规程

1目的：规定了高效液相色谱法的标准操作程序，便于规范操作。
2适用范围：适用于公司内用高效液相色谱法检测的产品。
3责任人：QC。
4程序内容
4.1 简述
4.1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后,各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理得到测定结果。
4.1.2常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。
4.1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理机组成。检测器最常用的为可变波长紫外光检测器或紫外-可见光检测器，色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。   
4.2 高效液相色谱仪的使用要求
4.2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705-90）”的规定作定期检定，应符合规定。

4.2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。
4.2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
4.3 流动相的制备：用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光度法进行溶剂检查应符合要求。水应为新鲜制备的高纯水，可用超级纯水器制得或用重蒸馏水。对规定PH值的流动相应使用精密PH计进行调节。配制好的流动相应通过0.45μm适宜的滤膜滤过，用前应脱气。应配制足量的流动相及时待用。
4.3.1 供试溶液的配制：供试品用规定溶剂配成供试溶液。定量测定时，对照品溶液配制1份，样品供试溶液配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经0.45μm适宜的滤膜滤过。必要时在配制供试溶液前，样品需经提取净化，以免对色谱系统产生污染。
4.3.2 检查上次使用记录和仪器状态：检查色谱柱是否适用于本次试验，色谱柱进出口位置是否与流动相的流向一致，原保存溶剂与现用流动相能否互溶，流动相的PH值与该色谱柱是否相适应。仪器是否完好，仪器的各开关位置是否处于关断的位置。
4.4 操作
4.4.1 泵的操作
4.4.1.1 用流动相冲洗滤器，再把滤器浸入流动相中，启动泵。
4.4.1.2 打开泵的排放阀，用专用注射器从阀口抽出流动相约20ml，设置高流速（9ml/min)或用冲洗键 PURGE 进行充泵排气，观查出口处流动相呈连续液流后，将流速逐步回零或停止（STOP）冲洗，关闭排放阀。
4.4.1.3 将流速调节至分析用流速，对色谱柱进行平衡，同时观察压力指示应稳定，用干燥滤纸片的边缘检查柱管各连接处应无渗漏，初始平衡时间，一般约需30分钟。
4.4.2 紫外可见光检测器和色谱数据处理机的操作：
4.4.2.1 开启检测器电源开关，选择光源（氘或钨）灯，选定检测波长，待稳定后测试参比和样品光路的信号应符合要求。设置吸收度方式和检测响应时间，（一般不大于1秒），设置满刻度吸收值（适用于记录仪）。
4.4.2.2 开启色谱处理机，设定处理方法，初步设定衰减，纸速，记录时间，最小峰面积等参数，或设定记录仪的纸速和衰减。
4.4.2.3 进行检测器回零操作，检查处理机的电平（LEVEL）应符合要求，或检查记录仪的笔应处在设定的起始位置，如有变动，可继续回零操作直至符合要求。
4.4.2.4 记录基线，待稳定后，进行处理机斜率测试，符合要求方能进行操作。
4.4.3 进样操作（方通阀式进样器）
4.4.3.1 把进样器手柄放在载样位置（LOAD)。
4.4.3.2 用供试溶液清洗配套的注射器，再抽取适量，用定量环(LOOP）载样，则注射器抽取量应不少于定量环容积的5倍，在排除气泡后方能向进样器中注入供试溶液。
4.4.3.3 把注射器的平头针直插至进样器的底部，注入供试溶液，除另有规定外，注射器不应取下。
4.4.3.4 把手柄转至注样位置（INJECT），定量环内供试溶液即被流动相带入流路。
4.4.4 色谱数据的收集和处理。
4.4.4.1 注样的同时启动数据处理机，开始采集和处理色谱信息，如系统记录仪，则注样同时按一下记号键作起记号。
4.4.4.2 最后一峰出完后，应继续走一段基线，确认再无组分流出，方能结束记录。
4.4.4.3 根据第一张预试的色谱图，适当调整衰减、纸速、记录时间等参数，使色谱峰信号在色谱图上有一定强度。定量测定中，一般峰顶不得超过记录满量程。再按（4.4.3.1-4.4.4.1)进行正式分析操作。
4.4.4.4 含量测定的对照溶液和样品供试溶液每份至少注样2次。由全部注样结果(n≥4)求得平均值，相对标准偏差（RSD）应不大于1.5%。
4.4.4.5 色谱系统适用性试验应符合中国药典的要求，如按指定峰计算的理论板数(n)和拖尾因子(T)及相邻峰之间的分离度(R)计算公式为：
            n=5.54(tR/Wh/2)2
其中：tR为保留时间，Wh/2为半高峰宽，取相同单位。
T=W0.05/(2d1)
其中：W0.05为离基线5%峰高处的峰宽，d1为峰上升边高5%峰高处的距离。
            R=2（tR2-tR1）/(W1+W2)=1.18(tR2-tR1)/(W1h/2+W2h/2)
其中：tR1和tR2分别为相邻前后二峰的保留时间，W1和W2则分别为其峰的底宽，T和W取相同单位。W1h/2、 W2h/2为峰1、2的半高峰宽。
4.4.5 测定结果处理
4.4.5.1 峰面积归一法
按药品标准有关项下进行峰面积归一法求组分含量的，按下式计算：
            百分含量[C%]=[∑Ai/∑A]×100%
其中∑Ai为被测含量组分峰面积，∑A为参与计算的全部峰面积之和。
4.4.5.2 内标法：用含对照品和内标物质的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式算出校正固子（f）：
            f=(As/ms)/(Ar/mr)
其中：As和Ar分别为内标物质和对照品的峰面积或峰高，ms和mr分别为加入内标物质和对照品的量。
    再根据含内标物质的供试品溶液色谱峰响应值，计算含量（mi）:
            mi=f×Ai/(As/ms)
其中：Ai和As分别为供试品和内标物质的峰面积或峰高，ms为加入内标物质的量，必要时，再根据稀释倍数，取样量和标示量折算成为标示量的百分含量，或根据稀释倍数和取样量折算成百分含量。
4.4.5.3 外标法：用含对照品的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式计算比值(r):     
r=Cr/Ar
其中：Cr和Ar分别为对照品的浓度和相应的峰面积和峰高。
再根据供试品溶液的色谱峰响应值，计算供试品中被测成分的浓度（Ci）:
         Ci=r×Ai
其中：Ai为供试品滤液中被测成分的峰面积或峰高。必要时，再根据稀释倍数和取样量折算成标示量的百分含量，或根据稀释倍数，取样量和标示量折算成百分含量。
4.5 清洗和关机
4.5.1 分析完毕后，先关检测器和数据处理机，再用适当经滤过和脱气的溶剂清洗色谱系统，正相柱一般用正己烷，反相柱如使用过含盐流动相，则先用水然后用甲醇冲洗，冲洗前先按（4.4.1.1-4.4.1.2)操作，再用分析流速冲洗，各冲洗溶剂一般冲洗30-60分钟，特殊情况应延长冲洗时间。
4.5.2 冲洗完毕后，逐步降低流速至0，关泵，进样器也应用相应溶剂冲洗，可使用进样阀所附专用冲洗接头。
4.5.3 关断电源，作好使用登记，内容包括日期，检品、流动相、柱压、使用小时数、仪器完好状态等。

4.6 注意事项：
4.6.1 色谱柱与进样器及其出口端与检测器之间应为无死体积连接，以免试样扩散影响分离。
4.6.2 新柱或被污染柱用适当溶剂冲洗时，应将其出口端与检测器脱开，避免污染。
4.6.3 使用的流动相应与仪器系统的原保存溶剂能互溶，如不互溶，则先取下上次的色谱柱，照（4.4.1.1和4.4.1.2）的方法用异丙醇冲洗过滤，进样器和检测器的流通池也注入异丙醇进行过滤，过滤完毕后，接上相应的色谱柱，换上本次使用的流动相，再按(4.4.1.1)顺序操作。
4.6.4 压力表无压力显示或压力波动时不能进行分析，应检查泵中气泡是否已排除，各连结处有无漏液，排除故障后方能进行操作。如压力升高，甚至自动停泵，应检查柱端有无污染堵塞，可小心卸下开柱的进口螺帽，挖出被污染填冲剂后，补入同类填充剂，仔细安装好，再进行操作。
4.6.5 发现记录基线波动，出现毛刺等现象，首先检查检测器流通池中是否有气泡或污染，如不是流通池引起，可等待氘灯稳定，同时检查仪器的接地是否良好，必要时，换上新的氘灯。仪器稳定后方能进行操作。
4.6.6 进样前，色谱柱应用流动相充分冲洗平衡，如系统适用性并不符合规定，或填充剂已损坏，则应更换新的同类色谱柱进行分析，由于同类填充剂的化学键合相的键合度及性能等存在一定差异，往往依操作达不到预定的分离时，可更换另一牌号的同类色谱柱进行试验。              
4.6.7 以硅胶作载体的化学键合相填充剂的稳定性受流动相PH值的影响，使用时，应详细参阅该柱的说明书，在规定的PH值范围内选用流动相时，一般PH范围为（4.5～7.5)。使用高PH值流动相时，可在泵与进样器之间连接一硅胶短柱，以饱和流动相。保护分析柱，并尽可能缩短在高PH 值下的使用时间，用后立即冲洗。
4.6.8 色谱流路系统，从泵、进样器、色谱柱，到检测器流通池，在分析完毕后均应按（4.5.1)充分冲洗。特别是用过含盐流动相的，更应注意先用水，再用甲醇充分冲洗。如发现泵漏液等较严重的情况，应请有经验的维修、人员进行检查，维修。
4.6.9 各色谱柱的使用应予登记，以方便选择和更新。

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有没有气象色谱方面的？？？

辛苦了，继续。

不错的资料

辛苦啦  谢谢分享

有没有气象色谱方面的？？？

谢谢楼主分享

只能适用于手动进样的仪器啊。