影响抗体药物稳定性的因素之糖基化修饰

作为一种重要的生物技术药物，单克隆抗体药物的出现，为癌症、自身免疫疾病以及病毒感染等多种疾病的治疗提供了全新的途径。糖基化修饰是单克隆抗体药物结构形成、功能发挥及药动学等生物学特性的重要影响因素，蛋白糖基化修饰最明显的作用就是其可以增加蛋白的稳定性及溶解度，单抗药物的糖基化修饰研究对于研发安全和有效的药物具有十分重要的意义。

许多影响细胞、组织、器官乃至生命的内源性蛋白或外源性重组蛋白(如治疗性重组蛋白或单克隆抗体),在细胞内成熟过程中几乎均会发生蛋白质糖基化修饰,而糖基化修饰的质量的差异,可能会影响相关蛋白的表达水平、结构及功能。糖基化可以通过隐藏蛋白与蛋白酶的结合位点而保护蛋白。有研究者发现N-糖基化对邻近多肽的位阻保护是由于糖基化与亲水性氨基酸形成了氢键。糖基化修饰还可以阻碍蛋白酶与抗体的结合，从而增加抗体的稳定性。

单抗药物的迅速发展及其在多种疾病治疗中日益凸显的重要性都对单克隆抗体的研发及用药安全等方面提出了更高的要求。单抗药物的糖基化修饰影响着单抗药物的稳定、有效和安全性，因此建立高效、快速、可靠的糖基化修饰定性、定量分析方法对其糖基化修饰进行全面表征具有十分重要的意义。美迪西生物分析部可以提供符合FDA/CFDA GLP的大分子药物生物分析服务，以支持蛋白药物、抗体药物、疫苗和生物标记物的筛选与开发，及其临床前研究和临床研究。

根据糖基化的修饰位点可将糖基化分为N位糖基化和O位糖基化。N位糖基化位于Asn-297，寡糖中的N-乙酰氨基葡萄糖与天冬酰胺残基上的酰胺氮连接修饰蛋白，起始于内质网完成于高尔基体；O位糖基化由寡糖中的N-乙酰半乳糖与丝氨酸或苏氨酸残基上的羟基连接修饰蛋白，在高尔基体完成。也有研究者探讨了糖基化修饰对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抗体融合蛋白(CTLA4-Ig)融合蛋白稳定性的影响[1].

研究者应用多种糖苷酶N-糖苷酶F(PNGase F)、内切糖苷酶F2(EndoF2)、唾液酸酶(neuraminidase)和O-糖苷酶(O-glycosidase)对样品进行处理。通过分子排阻色谱(SEC)测定不同酶切时间处理后样品纯度变化；应用差示扫描荧光(DSF)测定样品整体热力学参数的变化；应用差示扫描量热(DSC)测定样品各结构域热力学参数变化；在45℃条件下加热,分别于0、1、3、5、7、9、11和12周取样,通过SEC测定样品纯度的变化等。最后通过多种分析手段研究发现,糖基化修饰与CTLA4-Ig的稳定性密切相关。

蛋白质翻译后修饰是蛋白质结构及功能成熟过程中的重要组成部分，在众多的蛋白质翻译后修饰中糖基化修饰是最重要和最复杂的修饰之一，也是评价抗体的关键质量属性之一。单克隆抗体药物功能的实现与其糖基化修饰密切相关，因此在抗体药物研发中，我们需要重点关注单抗药物的糖基化修饰。

[1] 糖基化修饰对重组CTLA4-Ig稳定性影响的研究[J].

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