modRNA技术：一种蛋白表达新方法

早在上世纪90年代，注射裸信使核糖核酸（mRNA）已经能够在体内实现外源性蛋白的表达。然而，mRNA的不稳定性及高度免疫原性阻碍了这项技术的进一步发展与应用。近年来，随着对mRNA结构的认识深入及核酸技术的进步，可化学合成并修饰信使核糖核酸，即ChemicallysyntheticmodifiedmessageRNA（modRNA）。

化学合成修饰信使核糖核酸（modRNA）是指利用化学修饰的碱基在体外合成mRNA，为一种新型的基因载体。该技术以不同修饰的碱基为原料，将含有mRNA生物信息的DNA片段进行体外转录以合成modRNA，再经由脂质体或纳米颗粒等介质转入靶细胞中进行蛋白质的翻译表达，从而实现体内外快速、高效、脉冲式地表达具有生物活性的目标蛋白，以达到治疗疾病的目的。


1.modRNA与体细胞重编程
2010年，哈佛大学博士后Luigi Warren的实验团队开创性地体外合成表达Oct4/Sox2/c-Myc/Klf4这4个转录因子的5mC/ψ-modRNA，并将其共同导入多种人体细胞中[1]，最终诱导产生具有全能性的iPSCs，这为重编程及定向分化研究提供了一种全新且安全可靠的方法。

Luigi Warren的实验设计简图

2016年，Luni等[2]通过自动化的微流控系统进一步优化了体细胞重编程的微环境，增强了细胞自身及细胞间的自分泌及旁分泌作用，2周时间即可产生纯度高、均一性好的iPSCs，兼具成本低、远程控制等优点，为该技术更好地应用于基础研究、疾病治疗奠定了基础。值得注意的是，对比逆转录病毒，modRNA诱导的iPSCs在转录水平更接近于ESCs。

2.modRNA与组织再生

modRNA能有效调控靶细胞的分化、增殖，促进损伤后组织或器官结构及功能的恢复，故可作为组织修复与再生的一种有效治疗手段，尤其在心肌再生与骨修复方面的报道较多。

2013年，Lui等[3-4]率先利用编码VEGF的modRNA，促进心脏祖细胞向血管内皮细胞分化，从而有助于心肌细胞的增殖及存活，与DNA质粒相比，其在减少心梗范围、改善血供及加快心功能恢复方面效果更好，因而具有良好的临床应用价值。2018年，Carlsson等[5]进一步利用N1ψ-modVEGF在大型动物体内验证了modRNA技术在治疗心血管疾病方面的可行性。此外，有研究表明，心梗早期注射modIGF1（Insulin-likeGrowthFactor1，胰岛素样生长因子1）有利于心肌细胞的存活，进而能够有效地改善心梗的预后情况。


骨形态发生蛋白（BoneMorphogeneticProteins，BMPs）这类细胞因子在调控骨骼生长发育及促进骨修复再生中具有重要作用。modRNA作为一种高效、安全的基因替代技术，在该领域的潜在应用价值也逐渐受到了认可，近年来多篇文献报道，modBMP-2和modBMP-9结合纳米载体能够有效修复骨缺损，在骨再生中具有巨大的临床转化前景[6-7]。

3.modRNA与基因治疗

迄今为止，各种基因载体在基因缺陷疾病的替代治疗和目的蛋白的过表达领域中均取得了显著成果。在体外研究中，Wang等[8]通过病人来源的iPSCs构建组织工程心脏补片，经shRNA及crispr/cas9等基因编辑技术敲低或敲除Tafazzin基因（TAZ）来构建巴氏综合征（Barthsyndrome，BTHS）疾病模型，最后利用modRNA技术过表达TAZ来逆转疾病的进程，以此探索疾病发生发展的病理生理过程，并为临床药筛提供依据。在体内治疗中，肺表面活性蛋白-B（surfactantproteinB，SP-B）缺陷症是由于机体肺泡Ⅱ型上皮细胞产生SP-B不足引起的一种致死性肺部疾病。
2011年，Kormann等[9]让SPB缺陷的小鼠模型吸入modSP-B，发现能够有效弥补小鼠体内SP-B的缺失，改善呼吸系统的不良症状，显著提高生存率。此外，modEPO（促红细胞生成素，Erythropoietin）作为基因治疗的另一代表性成果，多项研究均表明，与未修饰的mRNA相比，modRNA能够显著提高mRNA的稳定性，抑制机体免疫应答的激活，进而实现更高水平、更长时间的EPO的表达，从而更有效地提高血液中红细胞水平[10-11]。

4.modRNA与疫苗mRNA

2017年，Nature和Cell均发表了modRNA疫苗在抗zika病毒中应用的报道，modRNA编码信号肽、zika病毒的前膜蛋白和包膜蛋白后，能够在宿主体内自组装成具有免疫原性而无感染能力的病毒样颗粒，进而激活免疫系统产生特异性免疫应答，最终实现保护小鼠甚至灵长类动物较长时间免受zika病毒感染及损害的目的[12-13]。


研究人员设计了一种脂质纳米粒(LNP)包被编码野生型或变异型zika病毒结构基因的修饰mRNA疫苗，并测试了其在小鼠体内的免疫原性和保护作用。两个剂量的编码PRM-E基因的改良mR-LNPs产生病毒样颗粒，产生较高的中和抗体滴度(～1/100,000)，可防止zika病毒感染并授予灭菌免疫。

此外，随着肿瘤疫苗研究的兴起，modRNA疫苗在肿瘤免疫治疗中的作用也逐渐引起了人们的关注，已经有科学家利用modRNA编码个体化突变的多个新表位或双特异性T细胞诱导抗体，成功招募并激活T淋巴细胞介导的特异性免疫应答[14]，从而达到抑制甚至清除肿瘤的目的。modRNA肿瘤疫苗不仅能够实现肿瘤治疗的个体化，还能够通过重复注射、持续表达的方式增强抗肿瘤的疗效，或许是肿瘤免疫治疗的一种新兴策略。

[1] Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA [J]. Cell Stem Cell,
2010,7(5):618-630.
[2] Luni C, Giulitti S, Serena E, et al. High -efficiency cellular reprogramming with microfluidics [J]. Nat Methods,2016,13 (5): 446-452.
[3] Lui KO, Zangi L, Silva EA, et al. Driving vascular endothelial cell fate of human multipotent Isl1+ heart progenitors with VEGF modified mRNA [J]. Cell Res,2013,23(10):1172-1186.
[4] Zangi L, Lui KO, von Gise A, et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction [J]. Nat Biotechnol,2013,31(10):898-907.
[5] Carlsson L, Clarke JC, Yen C, et al. Biocompatible, purified vegf-a mRNA improves cardiac function after intracardiac injection 1 week post-myocardial infarction in swine [J]. Mol Ther Methods Clin Dev,2018,9:330-346.
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[8] Wang G, McCain ML, Yang L, et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart -on -chip technologies [J]. Nat Med,2014,20 (6): 616-623.
[9] Kormann MS, Hasenpusch G, Aneja MK, et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice [J]. Nat Biotechnol,2011,29(2):154-157.
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[13] Richner JM, Himansu S, Dowd KA, et al. Modified mRNA vaccines protect against zika virus infection [J]. Cell,2017,168(6): 1114-1125.
[14] Stadler CR, Bahr-Mahmud H, Celik L, et al. Elimination of large tumors in mice by mRNA-encoded bispecific antibodies [J]. Nat Med,2017,23(7):815-817.