银杏内酯B注射液（EG-1注射液）

1.供试品、对照品与溶媒
1.1 供试品
        供试品名称：银杏内酯B注射液（EG-1注射液）
        生产单位：广州白云山天心制药有限公司
        规格、批号和数量：
        1ml∶10mg，420支，批号：100401
        性状：本品为无色澄明粘稠液体
        保存条件：避光，密封保存
        稳定性：18个月
        临床适应症状：治疗脑血管缺血性疾病
        人拟临床用剂量：一日一次，一次30-40mg
1.2 对照物
1.2.1 溶剂对照品
        名称：聚乙二醇600（药用）
        性状：白色或淡黄色膏状物
        规格、批号和数量：500ml, 批号：F20090223
        来源：由委托方提供。生产公司为     。批准文号：
        保存条件：密闭干燥处
        选择理由：因供试品直接静脉注射会引起静脉炎，故须稀释后给药；同时供试品水溶性较差，需使用增溶剂。根据委托方提供资料，采用5%聚乙二醇600作为溶媒。
1.2.2 阳性对照品
        名称：注射用环磷酰胺
        性状：白色结晶或结晶性粉末
        规格：1g/瓶
        批号：079K1569
        提供单位：Sigma公司
        贮存条件：遮光、密闭，2-8℃保存
2 试验仪器与试剂
2.1 仪器
        PL1501-S型电子分析天平，量程0～1510g，精度0.1g，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产；
        PL602-S型电子分析天平，量程0～610g，精度0.01g，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产；
        游标卡尺，量程0～150mm，精度0.01，上海量具刃具厂生产；
        Motic SMZ168—BL体视显微镜，中国麦克奥迪实业集团有限公司生产；
1.4.2 试剂
        氢氧化钾（AR），规格500g，批号T20100222，国药集团化学试剂有限公司生产；
        冰醋酸（AR），规格500ml，批号T20090629，国药集团化学试剂有限公司生产；
        医用酒精（AR），规格500ml，批号20091108，武汉市一轻江南公司竹叶酒精分装厂生产；
        丙三醇（AR），规格500ml，批号F2010427，国药集团化学试剂有限公司生产；
        甲醛（AR），规格500ml，批号20091027，国药集团化学试剂有限公司生产；
        苦味酸（AR），规格25g，批号0905204，汕头市西陇化工厂有限公司生产；
        茜素红，规格25g，批号20020413，湘中化学试剂研究所生产。
        生理盐水注射液，批号20091024，安徽双鹤药业有限公司生产，pH 6.6。
3．实验系统及饲养管理条件
3.1 实验动物
        SPF级SD大鼠，雌性，10－11周龄，220～240g，180只；雄性，9－10周龄，260～280g，90只。初始体重不超过或低于动物平均体重的20%。
        实验动物及饲料来源：上海实验动物资源中心（西普尔-必凯公司）。实验动物及饲料生产许可证号：SYXK（沪）2008-0058。实验动物质量合格证号：待定。
2.2 试验动物的领取
        试验动物运至SPF级动物实验区，通过传递窗经酒精喷雾表面消毒10分钟。大鼠进入屏障内后，立即拆开包装，检查动物性别、数量、体重是否合乎要求，精神状态、毛色等是否正常（HBCDC/SOP/A/0028/2006/01）。
2.3 动物的饲养及饲养条件
        动物饲养于SPF级万级屏障环境，温度20～25℃，换气次数10～20次/h，湿度40～70%，压强梯度20～50Pa，昼夜明暗交替时间12h/12h（HBCDC/SOP/A/0015/2006/01）。
        实验动物使用许可证号： SYXK（鄂）2008-0014。
        大鼠用聚丙烯PP/聚碳酸酯PC耐高温高压塑料盒饲养，未妊娠大鼠每盒2只(尺寸475*350*200mm)，妊娠大鼠单笼喂养(尺寸215*32*170mm)。每日添加1次辐照全价营养颗粒，批号待定。自由饮用灭菌水。
2.4 适应性喂养及检疫
        动物检疫期为7天，期间每日对动物进行外观检疫，主要内容包括动物皮毛有无光泽，有无脱毛现象；口、眼、鼻、耳周围有无分泌物；身体各部有无外伤和炎症；行为与步态是否正常；自主活动是否正常；大小便有无异常；摄食、饮水是否正常等（HBCDC/SOP/T/0001/2006/01）。
        检疫期开始和结束时称重。
        检疫合格的动物进入正式试验。
3．剂量设计
3.1 剂量设计依据：根据《化学药物生殖毒性试验研究技术指导原则》要求以及厂方提供资料设计剂量。
3.1.1 药效学试验资料
        委托方资料：银杏内酯B注射液的大鼠药效学剂量为1.5mg/kg/d和4.5mg/kg/d，这两个剂量都有效。故大鼠药效学最低有效剂量为1.5mg/kg/d。
3.1.2 小鼠急性毒性试验资料
        委托方资料：小鼠单次静脉注射给予银杏内酯B的LD50值为43.30mg/kg，95%可信限为38.78～48.35mg/kg。单剂量注射银杏内酯B 66.70mg/kg后小鼠立即出现俯卧不动、抽搐、鼻出血、排尿等反应，并于药后1分钟左右死亡。
3.1.3 大鼠长期毒性试验结果
        委托方资料：SD大鼠26wk连续静脉给予EG-1注射液，14.0mg/kg/g可引起动物出现呼吸急促、后肢无力、俯卧不动的症状，13wk、26wk后可引起血清中ALT含量的升高。病理学检查发现EG-1注射液对SD大鼠脏器相对重量无明显影响，且不引起动物脏器肉眼形态学及组织病理学改变，对给药部位均无明显刺激作用。故经综合分析确定SD大鼠无毒反应剂量为3.5mg/kg/d。约为人拟用临床剂量的7倍左右。EG-1注射液与空白辅料对照组相同剂量比较毒性基本一致，说明毒性反应主要是由空白辅料对照组所引起。
3.1.4 Ⅱ段生殖毒性试验资料
        委托方资料：设银杏内酯B注射液（EG-1注射液）高、中、低（14.3mg/kg、7.2mg/kg和3.6mg/kg）3个剂量组, 同时设1个阳性对照组（环磷酰胺对照组（10mg/kg）和维生素A对照组（3万单位/kg））及空白辅料对照组、溶媒对照组及生理盐水空白对照组，在孕鼠妊娠第6～15天尾静脉注射给药。结果显示：孕鼠在妊娠期间外观特征、行为活动及摄食量等一般状况良好，但阳性对照组环磷酰胺可以减缓孕鼠增重，影响动物心、肺、肾脏及脑等脏器系数，且可以导致活胎数量减少，吸收胎数量增加，延缓骨骼发育，引起明显的胚胎毒性及致畸效应，而银杏内酯B注射液（EG-1注射液）高中低剂量组黄体数、着床数及胎仔外观、内脏及骨骼畸型数与空白组间差异无统计学意义（P>0.05）。
3.1.5 本实验室资料：
　　根据委托方资料，供试品在5%聚乙二醇600溶液中最大可配浓度为0.7mg/kg,10分钟内保持为无色澄清溶液。
3.2 根据以上试验资料，本试验设6组，剂量如下：
        1）高剂量组：14.0mg/kg ，相当于拟用临床等效剂量的3.9倍左右,药效学有效剂量的9.3倍;
        2）中剂量组：7.0mg/kg，相当于拟用临床等效剂量的1.9倍左右,药效学有效剂量的4.7倍;
        3）低剂量组：3.5mg/kg，相当于拟用临床等效剂量的1.0倍左右,药效学有效剂量的2.3倍;
        4）空白对照组：生理盐水注射液；
        5）溶剂对照组：5%聚乙二醇溶液；
        6）阳性对照组：环磷酰胺10mg/kg。
        表1　银杏内酯B注射液（EG-1注射液）生殖毒性试验剂量设计
分组        动物数        剂量        给药容量        相当于人拟临床等效剂量的倍数        约为药效学有效剂量的倍数
        （只）        （mg/kg）                （ml/kg）               
空白对照组        20        0        20.0        0        0
溶剂对照组        20        0        20.0        0        0
环磷酰胺对照组        20        10（CP）        2.0        －        －
EG-1注射液低剂量组        20        3.5        20.0        1.0        2.3
EG-1注射液中剂量组        20        7.0        20.0        1.9        4.7
EG-1注射液高剂量组        20        14.0        20.0        3.9        9.3
        人拟临床用剂量40mg/70kg/天（0.571 mg/kg/天），折算成200g大鼠的等效剂量(按体表面积法折算)：40mg×0.018（70公斤人与200g大鼠等效剂量系数）=0.72 mg，即大鼠等效剂量为3.6 mg /kg BW。
4. 试剂、溶媒及供试品的配制
4.1 试剂（方法见：HBCDC/SOP/D/0602/2006/01）
        茜素红溶液的配制（10000ml）：准确称取茜素红1.00g,氢氧化钾100g,加入到盛有10000ml蒸馏水的烧杯中，并用玻棒不停搅拌使茜素红和氢氧化钾充分溶解，再倒入10000ml的小口玻璃瓶中，盖紧瓶塞，室温保存备用。
        透明液A的配制(10000ml)：准确量取甘油2000ml,称取氢氧化钾100g,加入到盛有7900 ml蒸馏水的烧杯中，并用玻棒不停搅拌使甘油和氢氧化钾充分溶解，再倒入10000ml的小口玻璃瓶中，盖紧瓶塞，室温保存备用。
        透明液B(10000ml)：准确量取甘油5000ml,加入到盛有5000ml蒸馏水的烧杯中，并用玻棒不停搅拌使甘油和蒸馏水混合均匀，再倒入10000 ml的小口玻璃瓶中，盖紧瓶塞，室温保存备用。
        保存液:甘油5000 ml
        固定液（Bouins液，10000ml）：2，4，6-三硝基酚（苦味酸饱和液）的配制：准确量取10000ml热蒸馏水（约60℃），向其中不断加入苦味酸，用玻棒搅拌使其充分溶解直至溶液饱和，待冷却后用四层纱布过滤。取苦味酸饱和液7500ml，置于50000ml的大烧杯中，再加入2000ml40%的甲醛溶液，最后加入500ml冰乙酸，搅拌均匀，再倒入10000 ml的小口玻璃瓶中，盖紧瓶塞，室温保存备用。
4.2 溶媒的配制：
        5%聚乙二醇溶液:采用无菌操作，用注射器吸取5ml聚乙二醇，注入装有95ml无菌生理盐水注射液的输液瓶中，混合均匀。备用。pH 5.2
4.3 供试品及对照品的配制：
        高剂量溶液配制：用注射器吸取7.0ml(70mg) 银杏内酯B注射液注入到装有100ml5%聚乙二醇溶液的输液瓶中，混合均匀。溶液浓度为0.70mg/ml；
        中剂量溶液配制：用注射器吸取3.5ml(35mg) 银杏内酯B注射液注入到装有100ml5%聚乙二醇溶液的输液瓶中，混合均匀。溶液浓度为0.35mg/ml；
        低剂量溶液配制：用注射器吸取1.8ml(18mg) 银杏内酯B注射液注入到装有100ml5%聚乙二醇溶液的输液瓶中，混合均匀。溶液浓度为0.18mg/ml；
        注射用环磷酰胺配制：取注射用环磷酰胺200mg，加入40ml生理盐水稀释后，浓度为5mg/ml，按照0.2ml/100g给予动物静脉注射。
5. 试验方法
5.1 动物合笼
        将大鼠按雌：雄为2：1的比例同笼，以5天为一个周期进行交配。合笼后次日晨（8:00～10:00）从笼中取出雌鼠，阴道分泌物涂片检查动物是否交配成功（方法见：HBCDC/SOP/D/0603/2006/01）。受孕动物计为妊娠第0天，并称取体重。
5.2 试验动物的编号、标识与分组
        将雌、雄动物分别用苦味酸和品红编号，从1到20。大鼠饲养笼挂上饲养卡，注明动物号、组别、剂量、怀孕日期等信息（HBCDC/SOP/T/0002/2006/01及HBCDC/SOP/T/0001/ 2006/01）。
5.3 给药部位及方法：动物妊娠后d6～d15，按照2.0ml/100g体重容量尾静脉注射给药，，每天给药一次。阳性对照组Ⅰ于妊娠d11，按照10mg/kg，一次性腹腔注射环磷酰胺。
        EG－1注射液临床为静脉滴注，本试验采用尾静脉注射的给药方法（方法见HBCDC/SOP/T /0010/2006/01中4.4），每次给药注射时间不低于40s。
5.4 观察指标
5.4.1 受孕动物的检查：
5.4.1.1 一般状况观察：每天进行外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便性状等症状观察，如动物出现中毒症状，实验人员应即时告知专题负责人，详细记录动物症状并将该动物单笼喂养，密切观察。方法见HBCDC/SOP/T/0027/2006/01。
5.4.1.2 体重及摄食量的测定（方法见HBCDC/SOP/D/0604/2006/01）
        交配前一天雌雄大鼠应称取体重及摄食量一次。
        孕鼠分别在妊娠第0、3、6、9、12、15、18、20天称体重。妊娠期增重＝解剖前体重-受孕第6天体重-子宫连胎重
        每周测定大鼠的进食量一次（孕鼠分别在妊娠第0、3、6、9、12、15、18天称取）。方法：第一天称加入食50g/只，第二天同一时间称剩食，摄食量（g/kg/天）＝(加食量－剩食量)/动物体重。
5.4.2 孕鼠的剖检
5.4.2.1 采用3%戊巴比妥钠麻醉孕鼠，取出子宫后处死母鼠。对孕鼠体重和处死日期进行记录。
5.4.2.2 剖检所有孕鼠，检查内容包括头部、躯干、四肢、胸腔、腹腔及盆腔各脏器组织。摘取动物心、肝、脾、肺、肾、脑、卵巢、输卵管、子宫和阴道等组织器官，称重后放入10%中性福尔马林溶液中，做病理切片以备进行组织学诊断（方法见HBCDC/SOP/D/0605/2006/01）。
5.4.2.3 检查卵巢和子宫，称取子宫和胎鼠重量，从左侧卵巢的末端开始，轻轻撕破每一胚胎的胎膜，取出胎鼠，计数黄体数、死胎（早期死胎、晚期死胎、吸收胎）数、活胎仔数及总着床数。看不见植入体的母鼠子宫，放入10％硫化铵液中，浸泡15—20min，着床腺将被染成黑色圆环。（方法见HBCDC/SOP/D/0605/2006/01）。
        黄体数：顺子宫角找到卵巢，卵巢中红略带黄色的鱼子状圆形体即为黄体，记录黄体数。
        子宫和胎鼠称重：暴露两侧子宫角，沿着肠系膜完整的切除子宫，将子宫连同胎仔取出，称重。记录重量后把子宫放在已预先用生理盐水浸湿的纸巾上。
        活胎：可观察到胎鼠心跳和(或)运动。
        死胎：未观察到胎鼠心跳和(或)运动，有清楚可辨的指(趾)，体重>0.3g。
        吸收胎：为子宫内一个或几个紫黑色圆形块物，不能辨认胚胎和胎盘。
        总着床数：总着床数＝活胎数+死胎数+吸收胎数
        活胎率(%) ＝活胎数÷胎鼠数×100%
        死胎率(%) ＝死胎数÷胎鼠数×100%
        吸收胎率(%) ＝吸收胎数÷着床数×100%
5.4.3 胎鼠检查：
5.4.3.1 称取胎鼠及胎盘重，测量身长及尾长，鉴定性别
        胎仔编号：为便于识别，给每一活胎或死胎都编号，编号顺序为从左卵巢至子宫颈，然后从右卵巢至子宫颈。
        称胎重：活胎放在生理盐水纱布上轻轻除去污渍，称重，小于0.5g的胎鼠判为发育迟缓。
        称胎盘重：小心剥离胎盘，称重。
        胎仔身长及尾长测量方法：在白纸上画一条直线，将胎鼠背侧自头至尾与直线对齐，用笔在直线上点出胎鼠头顶、尾根和尾尖。从头顶部至尾根部测出胎仔身长。从尾根部至尾尖部为胎仔尾长。
        性别的鉴定：根据动物生殖器（阴茎或阴户）与肛门之间的间距长短来判定。一般来说，雄鼠的生殖器距肛门较远，雌鼠生殖器距肛门较近。
5.4.3.2 胎鼠外观检查（方法见HBCDC/SOP/D/0605/2006/01）：
        用放大镜对每一胎鼠进行外观检查，主要检查内容如下：
       
        表2　　生殖毒性试验胎鼠外观检查主要内容
检查部位        检查内容
头部        头部形状有无异常，眼、耳，鼻、口的形状、位置及大小是否正常，打开口腔，观察舌、腭有无异常。
躯干部        有无脐疝、腹裂（内脏膨出）、脊髓膨出、脊柱裂和脊柱侧
四肢        大小、形状、位置及趾(指)的数目、分离情况等
肛门、生殖器、尾        注意有无肛门闭锁及位置异常，观察外生殖器的形状及大小，尾的长度及有无卷曲
5.4.3.3 胎鼠的内脏检查
        每窝选取1/2的活胎鼠，及所有外观畸形、发育迟缓的胎鼠进行内脏检查。被选取的胎鼠放入Bouin液中浸泡至少2周，取出胎仔，自来水冲洗后，用单面刀片进行头部切片检查；用显微解剖法检查胸部和腹部脏器。具体检查方法如下：
        (1)头部检查：检查时头置于蜡板上，用立体显微镜验证在外观检查时发现的畸形。记录所见外观异常，用解剖刀或单面刀片将头切5刀（如表3），分成6个断面，检查头的内部结构，记录所见畸形。遇到血肿、肿块、凹陷等应在其上再切一刀，以便查明引起这些异常的原因。
表　3　　　胎鼠头部畸形检查内容
        刀切部位        暴露结构        检查内容
第1刀        腹侧朝上，通过嘴至两耳的水平切面        舌、腭、上唇和下颌        切除舌后，检查腭和上唇是否完全闭合(腭裂和唇裂)。
第2刀        背朝上由双眼前方下切        鼻中隔，鼻窦和腭        鼻窦的形状及异常闭合
第3刀        由双眼切下        大脑的嗅叶、鼻中隔后部大部、鼻窦(鼻咽腔)和腭        视杯、视网膜、玻璃体、晶状体和角膜
第4刀        由双眼后面切下        大脑半球和侧脑室(第Ⅰ和第Ⅱ脑室)        各脑室有无异常的缩小或扩张(脑积水)
第5刀                位于间脑的第Ⅲ脑室        检查第Ⅲ脑室有无缩小或扩张
        胎仔头部畸形，除腭裂和开眼外(不必保存)，其它各种畸形的头部切片均分别贮存在含Bouin液的小瓶中，瓶的标签上注明供试品编号、处死日期、母体号、胎仔号、畸形种类等，必要时小瓶存放在暗盒里，以备进一步检查。
        （2）胎仔的内脏检查





表　4　　胎鼠内脏畸形检查内容
检查部位        检查内容
胸腔        胸腺：位于心脏腹面，有两叶，伸向心脏的前方、白色，表面光滑。
        气管和食管：检查气管和食管有无融合，有无气管食管瘘
        横膈膜：有无膈疝
        肺：啮齿类右肺有四叶，分三个正常肺叶和一个底叶，左肺只有一叶。计数肺叶数目
        检查主动脉弓有无狭窄、缺损或重复
        心脏：摘除心脏，将心脏切断为心底部和心尖部，面后将心尖部左右心室壁切除，使室中隔残留，检查室中隔有无缺损。
腹腔        肝叶：检查肝脏分叶（大鼠肝共分7叶，包括乳头叶和尾状叶），有无斑点及融合、质地和颜色是否正常。
        胃、脾、胰和幽门括约肌
        胆囊和胆管，注意大鼠无胆囊。
        小肠和大肠有无变异
        肾上腺的大小和位置
        肾、输尿管、膀胱、肾血管、肾乳头、肾盂
盆腔        雌：卵巢、输卵管、子宫角和子宫体、子宫颈、卵巢子宫索。
        雄；睾丸、附睾、输精管、睾丸韧带
检查出头部和内脏畸形的胎鼠均要保存，小瓶上贴好标签，注名剂量组、母鼠号、胎鼠号和畸形类别。
        畸形率(%) ＝畸形仔鼠数÷受检胎鼠数×100%

发这个干吗啊，为了积分？

学习下,感谢分享~~~