基于载体材料表面修饰的靶向给药系统

近年来，许多新型给药系统如纳米粒、脂质体等，都具有靶向、缓释、控释、降低全身毒副作用等优点，是目前制剂学最具发展潜力的一个领域。然而也存在一些缺点，最主要表现在进入体内后不稳定，实际到达靶区的药量有限，与理想的靶向制剂还有一定差距。人体对外来异物有很高的识别能力，当载药纳米粒、脂质体等进入人体后会被肝脾内的单核巨噬细胞系统(MPS)识别，随后被清除体外，对于需要靶向至肝脾以外的药物，这就严重影响了药物的疗效。但如果选择了合适的载体材料，并对该载体材料进行了恰如其分的表面修饰，那么结果可能会不一样。此类载体材料必须无毒，而且要有良好的生物相容性，可生物降解，不与药物发生化学反应以致失去药效，同时给药后能以一定的速度释药。对载体材料进行表面修饰可使给药系统具有更高的靶向性。目前常用如下几种方法。
1        增加载体材料的表面亲水性
1.1  用于制备纳米粒的载体材料
机体MPS系统识别异物的机制是，当异物进入体内后许多蛋白成分迅速吸附于纳米粒表面。影响因素考察结果表明除了纳米粒的粒径大小外，表面的疏水性也决定了纳米粒对血液成分中蛋白质(调理素)的吸附。调理素（opsonin系血清中的一种抗体物质，它能使细菌或其他外源物质易受感染从而促进MPS的吞噬作用）附着于纳米粒表面称为调理作用，这是纳米粒与吞噬细胞间的桥梁。曾有人专门做了聚苯乙烯纳米粒蛋白吸附的动力学研究，结果表明阿朴脂蛋白A-I，C-Ⅲ，E，J，纤维蛋白原和白蛋白都是吸附于纳米粒表面的主要蛋白成分。倘若增加纳米粒的表面亲水性，就可减少调理素的吸附。由于聚乙二醇(PEG)具有柔韧的亲水性长链结构，又可生物降解，用它进行表面修饰与其他长循环系统相比，更有利于增加纳米粒表面稳定性，控制药物释放，因此是目前研究最多的用于修饰的载体材料。经PEG修饰的纳米粒具有长循环特征，减少肝脾的摄取主要取决于相对分子质量和表面PEG的密度。如PEG链的相互距离从6.2nm降到5.1nm时，阿朴脂蛋白的吸附可降低90％以上，再进一步减小距离对蛋白吸附的影响就很小了[1]。PEG对载体的保护作用主要是因为它那柔软、易变形的高分子亲水链在纳米粒表面形成一层厚厚的“云层”，阻止其他聚合物与之发生相互作用，空间位阻和范德华力与相互作用的自由能紧密相关。PEG的亲水性柔韧长链及其高密度覆盖层是减小蛋白吸附的必要条件，表面PEG链的密度比长短对于空间位阻效应和范德华力更为重要[2,3]。要想用PEG修饰载体，首先应对PEG进行活化，对PEG的末端可进行多种活化方法，普遍采用是酯化法，将PEG先转化为羧酸得到活化酯，然后再与聚乳酸、壳聚糖、白蛋白、聚羟基乙酸、聚十六烷基腈基丙烯酸酯等载体材料发生偶联。PEG修饰纳米粒的制备方法有：透析法、沉淀/溶剂蒸发法、乳化/溶剂蒸发法、复乳法等。
将聚乳酸(PLA)和PEG混合材料作为载体制成的纳米粒，因为其静注后具有长循环作用而成为一种极具前景的药物传递系统[4]。有人研究了PLA-PEG的稳定性，发现在血清中培养时，分子量大的共聚分散体系由于吸附有血浆蛋白而变得稳定，因而在生理条件下该纳米粒分散体系是稳定的，适合于静脉给药。在模拟胃肠液的稳定性试验中发现PEG-PLA纳米粒较PLA纳米粒更为稳定，原因在于PEG包裹纳米粒对消化液蛋白产生排斥作用，因此可认为是由于PEG链的存在降低了PLA被消化降解的程度，实验结果还发现PEG-PLA纳米粒在胃液中的释放速度较慢，在肠液中较快，因此作为传统的口服给药中，PEG-PLA纳米粒有足够的稳定性用于控缓释。用PEO（聚环氧乙烷poly(ethylene oxide)）对纳米粒（60～200nm）进行表面修饰也可避免MPS的吞噬达到长循环的目的，它对载体的保护作用及机制与PEG相似。
磁靶向制剂属于一种物理化学靶向给药系统，如果在此基础上再对载体表面进行一定修饰，将会赋予给药系统更好的靶向性。国内有人合成了Fe3O4/PVA（聚乙烯醇）高分子磁性微球，再采用悬浮聚合的方法，使微球表面产生可用于功能化的羟基，再在碱性条件下加入环氧氯丙烷反应，使羟基活化产生环氧基团。最后与含有PEG的二甲基甲酰胺发应，获得了固载有较高含量的功能化PEG侧链的PVA高分子磁性微球.，粒度分布较窄，具有超顺磁性和较强的磁响应性，具有良好的酸碱稳定性和热稳定性。
两性分子环糊精（CYD）纳米粒CYD－NPs或含有CYD的混合聚合物制备出的纳米粒都有靶向作用，因为两亲性CYD的存在也可避免MPS的吞噬[14]。以偶联法合成环糊精（CYD）接枝聚乳酸（PLA）共聚物CYD-g-PLA,将PLA末端羧基转变为高反应活性的酰氯，然后通过PLA末端的酰氯与CYD上羟基反应，将PLA支链偶联到CYD上，得到CYD-g-PLA共聚物，亲水性试验表明，CYD接枝共聚物较PLA均聚物在水中具有更高的浸润性，说明在PLA存在下将CYD引入，能明显改善PLA的亲水性和降解性。
1.2 用于制备脂质体的载体材料
磷脂具有一定的药理活性，而且无毒无不良作用；作为药物辅料，磷脂能增强药物
活性，降低药物毒性，提高药物稳定性，使药物靶向释放到病灶区，延长药效，利于药物吸收，使活性成分充分发挥效力。由磷脂和服固醇制成的双分子层模拟生物膜已经在医药领域中广泛应用，已有由磷脂双分子膜包裹药物制成的脂质体注射剂已通过临床实验。但是，脂质体稳定性差和包封率低的问题仍然困扰着该领域的研究者。其主要原因在于小分子磷脂制成的双分子膜很容易发生相变和其它破坏性变化，这不仅影响脂质体的稳定性和药物的包封率，甚至威胁用药的安全性。从磷脂的分子结构上看，磷脂的活性基团主要表现在酯键、不饱和键和磷脂的取代基上，能发生水解反应、皂化反应、加成反应和酰化反应。但如果利用这些化学反应向天然磷脂分子中引入某些基团，使其结构和理化性质发生变化，就可实现天然磷脂的改性。例如，在脑磷脂的伯氨基上引入一个乙酰基，脑磷脂的亲水亲油平衡值(HLB)就会发生变化，乳化作用也会随之加强；在酸性条件下，向提纯的大豆磷脂中加入适量的H202，加热，得到在水中具有高度分散性能的羟化磷脂；次氯酸钠在酸性条件下与大豆磷脂发生加成反应制得羟氯化磷脂，其润湿性和分散性能都明显提高；在不饱和键上加氢得到的氢化磷脂可以有效地防止磷脂氧化变质。另外利用肿瘤组织附近的PH值比周围正常组织低的特点，制成pH敏感脂质体可靶向释药到这些部位。其原理是pH低时可导致脂肪酯羧基的质子化而引起六角晶相的形成，这是膜融合的主要机制。在酸性条件下，即在内涵体形成后几分钟内，进入溶酶体之前，PH从7.4减至5.3～6.3左右时，pH敏感脂质体膜发生结构改变，促使脂质体膜与内涵体／溶酶体膜的融合，将包封的药物主动靶向病变组织，避免网状内皮系统的清除。应用不同的膜材或通过调节脂质组成比例，可获得具不同pH敏感性的脂质体。如Kono等应用琥珀酰多聚甘油与磷脂酰胆碱制备的脂质体，在PH 7.4时可保持稳定；而随着癌症病变部位pH的降低，内容物释放急剧增加[5]。
通过表面修饰增加脂质体表面的亲水性同样可以达到长循环的目的。90年代初Blume等采用聚乙二醇单甲醚(PEG-MM)与磷脂酰乙醇胺(PE)结合成酯(PEG-PE)，将其组装于脂质体膜上，对延长血循环中脂质体寿命取得了较好结果。Klibanov等用聚乙二醇—二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE）对脂质体膜进行修饰，研制出一种长循环脂质体，不但提高了对靶向组织的选择性，而且能够逃避网状内皮系统的捕获，被称为 “隐形脂质体”(stealth  liposomes)。国内有人就采用两亲性PEG-DSPE修饰脂质体膜的方法，分别制备紫杉醇和米托蒽醌的隐形长循环脂质体。最后得到包封率高、粒度小的脂质体。
通过PEG修饰脂质体膜，长循环脂质体较普通脂质体在血液中的清除速度显著减
慢，平均滞留时间MRT由普通脂质体的3.58h提高到长循环脂质体的9.80h。AUC由普通脂质体的17.52mg﹒h﹒L-1提高到长循环脂质体的112.96 mg﹒h﹒L-1，证明长循环脂质体能十分有效的提高药物的生物利用度[6]。当然，载体经PEG修饰后能达到长循环的目的，除了与它增加表面亲水性减少调理素的吸附外，还与许多其他因素有关，比如，增加了载体的生物相容性、减弱了免疫原性和抗原性，增加了内容物的稳定性、减少其泄漏，同时还增加了药代动力学的剂量依赖关系。
另外，添加特殊非离子表面活性剂也能使纳米粒和脂质体具有长循环的特征。硬脂酸是一种内源性的生理物质，是机体脂肪的主要成分和能量的主要来源，体内有现成的降解途径，生物相容性较好，是理想的载体材料。Brij- 78(polyoxyethylene 20 atearyl ether),Myrj 53(polyoxyethylene 50 stearate)和Myri 59（polyoxyethylene  100  stearate）是3种亲脂端为硬脂基、亲水端为PEG长链的非离子性表面活性剂，其对应的PEG的分子量分别为l 000，2000和5000。这样，以硬脂酸为载体材料，以Brij 78，Myrj 53和Myrj 59为表面活性剂制备纳米粒时，PEG可有效地结合在纳米粒的表面。 有人用体外细胞吞噬实验证明Myrj 59也即分子量为5000的PEG比 Brij 78，Myrj 53修饰纳米粒其抵抗细胞摄取的能力较强。另一类非离子表面活性剂聚氧乙烯-聚氧丙稀共聚物Poloxamine和Poloxamer也能使纳米粒和脂质体具有长循环的特征，如用添加了Poloxamine908的纳米粒与相同粒径未包衣的纳米粒相比较显著的延长了药物在体内的循环时间[7]。用20％Poloxamer-188和40％Poloxamer-338混合包裹纳米粒，也可降低肝摄取量。纳米粒被聚山梨酯-80修饰后都能使药物穿过血脑屏障，明显增加脑部摄取量。有人研究，经聚山梨酯-80修饰的聚氰基丙稀酸正丁酯（PBCA）阿霉素纳米粒比单纯的PBCA阿霉素纳米粒在脑中的血药浓度高出60倍[8,9]！
2  使用特异性单克隆抗体或受体介导细胞靶向的载体材料
细胞表面具有特异受体，从理论上讲就可能与特异性配体结合，或使单抗与特异性抗原结合，从而将药物导向目的细胞或组织，进而改变其生物分布。单抗、受体与载体材料相偶联，所利用的化学基团主要有羧基、氨基、羟基、羰基和巯基等，这对载体材料的要求非常苛刻，最常用的是白蛋白和壳聚糖。单抗/受体与载体材料交联反应的类型很多，如用于氨基与氨基交联的戊二醛法、SPDP法、苯丁酸氮芥衍生物法；还有用于氨基与羧基的交联所用到的碳二亚胺法、由碳二亚胺法改进的活泼酯法、混合酸酐法、多元酸酐法等。将单抗或受体与载体相偶联通常需要使用偶联剂，使用最多的是双功能偶联剂琥珀酰亚胺基-3-（2-吡啶二硫）丙酸酯（N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate）SPDP。利用 SPDP分子一端的活泼酯组分与某一蛋白质分子的氨基反应，将该蛋白质与SPDP连接在一起；另一端的2-吡啶基基团可与另一蛋白质分子的巯基反应，通过巯基—二硫键交换反应，从而实现单抗/受体与载体材料的交联。其他比较常用的偶联剂还有琥珀酰亚胺S－乙酰硫代乙酸脂（SATA）和N-羟基琥珀酰亚胺棕榈酸酯（NHSP）等。
国内已有学者研究了第三代免疫脂质体（IML），将人膀胱癌单抗与脂质体表面聚乙二醇羧酸（PEG－COOH）端相联，使构成的脂质体既充分发挥PEG的保护功能延长药物血循环时间，又使单抗伸展在外部充分发挥其寻靶作用，以人膀胱癌靶细胞EJ和人直肠癌非靶细胞LOVO进行体外杀伤和体内肿瘤的抑瘤实验，结果表明，有单抗导向组较无单抗导向组抑瘤率有显著差异（P<0.05）。由此证实载阿霉素免疫脂质体在裸鼠体内能主动寻靶，将抗癌药物浓集于靶组织，从而明显提高抑癌效果[10]。又如，将抗酸性铁蛋白单克隆抗体（McAb-PAF）与多柔比星聚氯氰基丙烯酸正丁酯磷脂纳米粒相联，得到肝癌特异性多柔比星免疫磷脂纳米粒，多柔比星免疫磷脂纳米粒对肝癌细胞平均抑瘤率（81.96％）明显高于普通多柔比星脂质体（49.17％）。且与普通脂质体相比，其体内药物消除半衰期大大延长，在肝肿瘤中药物分布明显增加，对心脏、肾等组织的毒性也明显减小[11]。双功能抗体是一种抗体分子与另一种功能分子结合而成，使得靶细胞和功能分子之间架起桥梁，并激发具有导向性的免疫反应，产生特异性肿瘤杀伤效应。冯青杰[12]等通过化学偶联法制备单抗人喉癌/抗CD3双功能抗体，由于这种双功能抗体既能与癌细胞结合同时又能激活T淋巴细胞，结果表明，抗CD3对T淋巴细胞有较高的杀瘤活性和较低的IL-2依赖性。
肝实质细胞膜上存在无唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）、转铁蛋白受体等，而非实质细胞膜上分布有甘露糖受体、低密度脂蛋白受体及清除受体等，针对上述不同受体，对药物和载体进行修饰，通过受体-配体的特异性相互作用，达到药物的细胞靶向[13,14]。叶酸受体是一种在肿瘤细胞膜表面高度表达的蛋白膜受体，有ɑ和&szlig;两种亚型，它们对叶酸及其类似物都有很高的亲和力。叶酸受体在几乎所有的卵巢癌和大部分的恶性肿瘤如鼻炎癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌等中都有表达，同时在正常组织的表达高度保守。Ni S等用柔红霉素与叶酸偶联将其导入鼻炎癌细胞和中国仓鼠卵巢细胞，细胞摄取复合柔红霉素较游离柔红霉素分别增强9.4倍和40倍，细胞毒性增强18倍和49倍[15,16]。另外，也可在磁性纳米粒表面接上特异单抗或受体，制成磁性微球介导的主动靶向制剂，在磁导向和抗体/受体主动寻靶的双重作用下，药物将更有效地被运送至靶区。
3  改变载体材料表面电荷
纳米粒的表面性质对它与生物体的相互作用起关键作用，实验研究表明，带负电荷的微粒ζ电势的绝对值越大，静注后越易为肝的网状内皮系统滞留而积集于肝，带正电荷的微粒则易被肺的毛细血管截留而积集于肺。例如带有电荷的肽配基结合在PEG链的末梢，由此组成的纳米粒衣壳的PEG带电性质改变了纳米粒的表面特征。通过还原性氨化作用在聚乙二醇-聚D,L乳酸共聚物（a-acetal-poly(ethylene glycol)-poly(D,L-lactide) block copolymer (acetal-PEG-PDLLA)）的表面外围醛基上结合带电的肽配基。酪氨酸（Tyr）和酪氨酸-谷氨酸的结合物（Tyr-Glu）分别被结合在纳米粒表面上。在pH=7.4生理环境中，Tyr和Tyr-Glu修饰的纳米粒分别呈电中性和电负性，zeta电位分别是1.3mv和-10.6mv。Tyr和Tyr-Glu纳米粒在小鼠体内的有效血药浓度可维持24h（以前报道的不经修饰的同种给药系统血浆半衰期通常只有3～8h），二者无显著差异，表明负电荷对血液清除率无明显影响。对Tyr和Tyr-Glu纳米粒的组织分布考察表明它们分别只有6%～8%和0.1%～1%被肝脾吞噬（普通剂型则通常为20%～40%）。带负电荷的Tyr-Glu-PEG-PDLLA比Tyr-PEG-PDLLA对肝脾巨噬细胞的趋向性更弱，这种现象可以用原子的空间位阻和与细胞表面的静电斥力来解释[17]。而阳离于脂质体选用酸性磷脂，如二棕榈酰甘油磷脂和磷脂酰丝氨酸，可通过吸收介导的胞吞作用更为高效地进入BBB。
一项双盲安慰剂对照试验表明，8例囊性纤维化病人，鼻粘膜喷雾给药，精氨正电荷脂质GL-67提高了对肺的靶向性同时也提高了囊性纤维化跨膜转导调节因子（CFTR）基因质粒的转染[18]。在脂质、胆固醇或不饱和磷脂酰乙醇胺分子的头基上接一个线性正电荷，用于DNA缩合以增强DNA-脂质体在胞浆内释放的实验中，用一种T型正电荷头基结构的精胺，如3-&szlig;(N-精胺羰基)胆固醇（GL-67），通过胆固醇接入脂质体，与不带电荷或带有其他线性正电荷头基的阳离子脂质体相比，对肺的靶向性和质粒DNA的转染效率都明显增高[19]。
4  结语
靶向给药系统能将药物定向运送至靶区，减少药物在正常组织的分布，提高疗效，减少药物用量，降低毒副作用，正因为这些优点它引起了国内外众多药剂工作者的浓厚兴趣，目前全世界都掀起了一股研究靶向制剂的热潮，特别是抗癌类靶向制剂尤为突出。但作为一种正在发展的新剂型，它还存在一些有待克服的缺点，比如实际靶向性并不强，不能达到理想的药效，因此在设计这类制剂时，应根据药物自身的性质、靶区的特点，通过选择合适的载体材料，并对载体进行恰当的表面修饰，最终达到靶向制剂高效、安全的目的。